水稻是一种主要粮食作物，是全球40多亿人的主要食物。稻瘟病严重影响水稻的生长和产量。稻瘟病菌侵染造成水稻年产量损失约10％-30％。

因此，提高水稻品种对稻瘟病的抗性被认为是一种既经济又环保的提高水稻产量和品质的方法。

与传统化学农药方法在水稻生产过程中造成额外成本和环境污染问题相比，抗病基因的应用被认为是最大限度地减少病害造成的产量损失和质量损失的最佳策略。

通过将分子标记辅助选择鉴定的广谱稻瘟病抗性基因转移到易感基因型中，可以产生抗性水稻品种。

植物已经进化出各种机制来保护它们免受病原体的入侵和定植。

因此，在水稻品种中加入多种广谱抗稻瘟病基因将延长水稻的抗病性寿命。许多抗性基因位于串联重复区域，已被证明具有广谱抗性。

其中，在水稻6号染色体短臂串联重复区克隆的一系列广谱抗病基因在中国大部分水稻产区表现出较好的抗性水平。

然而，位于11号染色体长臂串联重复区Pik-m、Pik-s和Pi1等广谱抗性基因在中国不同水稻产区表现出不同的抗性水平。

这些基因在南方水稻产区表现出优异的抗性，但在北方水稻产区表现出易感。由于将多个广谱抗稻瘟病基因整合到水稻品种中可以大大延长抗病性寿命，因此在Pik位点挖掘广谱抗病性基因对于北方水稻产区具有重要意义。

从水稻品种、核心遗传资源或核心种质和海外品种中挖掘Pik-m基因的等位基因，不仅有助于鉴定北方水稻产区植物的高抗性基因，而且有助于鉴定遗传变异并深入了解该位点的进化。

然后将基因序列的变化与表型性状相关联，以确定未来应用的有利等位基因。

从筛选的抗性材料中扩增和测序Pik等位基因

分析Pik等位基因的结构变异和分子进化

(3)利用BC3F2近等基因系将观察到的抗性与Pik等位基因的存在联系起来。

1.等位基因挖掘抗性材料筛选

收集水稻资料余份，其中华中农业大学提供的核心种质资源个，黑龙江农业科学院提供的品种个，美国农业部、中国水稻研究所等机构提供的品种多个。

所选材料代表两个主要亚种:籼稻(约75%)和粳稻(约25%)。

为了评价这些材料的稻瘟病表型，我们在稻瘟病高发地区，如湖北省恩施和宜昌，以及黑龙江省佳木斯种植水稻植株。

根据国际水稻研究所(IRRI)的稻瘟病抗性分类标准，稻瘟病抗性分为6个类别:HR(高抗性)、R(抗性)、MR(中等抗性)、MS(中等敏感性)、S(敏感性)和HS(高敏感性)。

在恩施、宜昌和佳木斯共鉴定出份抗性表型(HR、R或MR)。对Pik-m、Pik-s、Pik-p或Pi1的pcr筛选(表S1和S2)确定了份候选等位基因挖掘。

2.Pik等位基因的测序分离

从份抗性材料中扩增出约13kb的基因组序列。13kb片段包括Pik-1和Pik-2的全长编码区(bp)和全长编码区(bp)。

通过对该片段个种质的序列分析，发现位于该片段的Pik-m、Pik-s、Pik-p和Pi1在种质间的分布差异很大。

其中，Pik-yd等位基因是分布最广的，共出现在49份水稻材料中。Pik-NS和Pik-R0也分布广泛，分别出现在19份和10份水稻材料中。其余等位基因相对较少，在5份材料中检测到。

其中，Pik-ME和Pik-CE最为罕见，仅在1个基因中检测到。这份材料中等位基因较少，说明该位点存在选择压力。在该位点挖掘新的等位基因可以丰富抗性基因的来源。

3.对Pik等位基因的序列分析表明，Pik-2具有保守性

在鉴定的7个Pik等位基因中，Pik-yd与参考基因Pik-m的基因组序列同源性最低(97.16%)，而Pik-ns的基因组序列同源性最高(99.85%)(表1)。

这7个等位基因与Pi1、Pik-p、Pik-h、Pik-m和Pik-s在snp和InDels上存在独特或共有的差异(图2)。S1和S2)。

Pik-m包括Pik-1和Pik-2，它们背靠背排列(图1-A)。新发现的Pik-1等位基因包括1个大InDel(约36bp)和3个小InDel(1个9bp和2个3bp)。在Pik-ME，CE，，YD中存在3bp的大插入和2个缺失，在Pik-ME，YD中存在9bp的插入。

新发现的Pik-2等位基因仅含snp，不含InDels。Pik-m蛋白由两个基因Pik-1和Pik-2编码。由Pik-1编码的蛋白含有典型的卷曲卷曲核苷酸结合位点-亮氨酸丰富重复(CC-NBSLRR)抗病结构域，而Pik-2蛋白具有CC-NBS结构域(图1-B和c)。

所有新鉴定的等位基因均具有完整的开放阅读框(orf)，与Pik-1和Pik-2相似。该等位基因的预测编码蛋白与对照Pik-1(94.59%±99.91%)和Pik-2(99.51%±.00%)蛋白序列高度相似(表2)。

与Pik-1编码的蛋白相比，Pik-2编码的蛋白具有更高的保守性。与参考蛋白Pik-m相比，等位基因蛋白的氨基酸变化主要发生在Pik-1位点。在Pik-2位点，克隆的Pi1和Pik-s基因编码与参考序列相同的氨基酸。

对Pik等位基因的序列分析显示，该位点高度相似，特别是在Pik-2位点，这意味着该位点对植物的生存很重要，因此受到正选择的影响。

4.新型匹克等位基因的系统发育与分布

4个广谱R基因位于水稻11号染色体长臂末端约27.5Mb的位置。为了检验这7个新等位基因与克隆的内参基因之间的遗传相关性，我们对这7个新等位基因进行了系统发育分析。

利用基因组序列(图2-A)和蛋白质序列(图2-B)构建系统发育树。从基因组序列中得到的结果与蛋白质相似(图2)。Pik-1和Pik-2位点的等位基因高度相似，这意味着Pik的两个位点可能与抗性功能有关。

5.田间小麦抗性等位基因的筛选

选择携带7个新的Pik等位基因或3个克隆基因(Pik-m、Pik-s和Pi1)的材料进行田间抗病性评价。

在恩施、宜昌和佳木斯对所选材料进行了叶片瘟病抗性试验。在恩施和宜昌，携带Pik-s或Pi1的品系表现出高于R(抗性)的抗性水平(表3)。携带Pik-NS、Pik-R0、Pik-ME或Pik-YD的品系表现出类似的结果，对叶瘟病的抗性比对照显著提高，至少具有中等抗性。

携带Pik-ZH的材料对叶瘟病的抗性没有显著增强，但在湖北省的植株中表现出高敏感性，而在黑龙江省的植株中表现出中等抗性。携带Pik-CE和Pik-的种质在不同地区表现出不同程度的抗性。

从田间表型上看，Pik等位基因供体(除Pik-zh外)的抗性普遍优于该位点克隆Pik-m基因的供体。

6.利用米曲菌分离株筛选高抗性等位基因

利用31M对携带7个新Pik等位基因或3个克隆基因(Pik-M、Pik-s和Pi1)的材料进行叶片抗稻瘟病性分析。

黑龙江稻瘟菌分离株。携带Pik-m、Pik-s或Pi1基因的品种分别为Tsuyuake、Jiahua1和Tetep，它们对稻瘟病表现出广谱抗性。

虽然供体(Pik-m、Pik-s和Pi1)的耐药率为77.42%~.00%，但非供体(Pik-m和Pi1)的耐药率仅为0.00%~16.13%(表4)。

携带Pik-等位基因的IR5-22-1-1-2-2对31株稻瘟病菌株均具有抗性，抗性率为%。带有Pik-R0等位基因的R和带有Pik-ME等位基因的梅香展共有耐药率均大于80%。

将这3个抗性均大于80%的Pik等位基因和4个克隆基因(Pik-m、Pi1、Pi2和Pi9)导入到空育中。

相应NILs的耐药率为29.03%~48.34%，抗病分数为4.16~5.26，显著优于回交亲本空育的耐药率为0%，抗病分数为7.45。

除了pi21、Pid2、Pid3、Pid4、Pb1和Ptr等少数基因外，大多数胚R基因都含有NLR结构域。对克隆的母细胞R基因的分析表明，大多数广谱R基因位于基因组的串联重复区。

抗稻瘟病R基因的全基因组分析表明，具有CC-NBS结构域的串联重复区存在于染色体1、6、9、11和12上。

其中，位于6号染色体短臂上的Pi2/Pi9位点克隆了Pi2、Pi9、Pigm、Pizt和Pi50基因，位于11号染色体长臂上的Pi1、Pik-m、Pik-h和Pik-p基因的Pik位点克隆了Pi1、Pik-m、Pik-h和Pik-p基因，赋予了稻谷分枝杆菌对各种分离株的广谱抗性。

Pik位点一般由串联的两个拷贝组成。

与大多数稻瘟病抗性基因一样，位于Pik位点的抗病克隆也含有CC-NBS-LRR抗病保守结构域。Pik-1具有完整的CC-NBS-lrr结构，而Pik-2只有CC-NBS保守结构域(图1-B和-C)。

根据我们的分析(图1-A)，该位点被显著正向选择，这意味着该位点与水稻的重要功能有关，如稻瘟病抗性。

在一些研究中，这些广谱抗性基因已被转移到敏感水稻品种中，位于6号和11号染色体串联重复区的基因对稻瘟病具有最广谱抗性。因此，我们认为挖掘Pik位点的等位基因将极大地丰富抗性基因。

中国是亚洲最重要的水稻产区之一，亚洲水稻品种主要在中国种植。亚洲水稻品种包括两个主要亚种，籼稻和粳稻。

在中国，南方多种植籼稻，北方多种植粳稻。稻瘟病是所有水稻种植区的一种毁灭性病害，稻瘟病的主要分离菌株在不同的水稻产区是不同的。

因此，不同水稻产区对R基因的抗性差异很大。中国不同产稻区稻瘟病田间试验的结果与这一观察结果一致(表3)。

在中国主要产稻区，6号染色体短臂上Pi2/Pi9位点的Pigm表现出至少中等抗性。然而，11号染色体长臂上的Pik位点上的Pi1、Pik、Pik-m、Pik-p、Pik-s、Pik-h和Pik-e7个基因仅在南方水稻区表现出良好的抗性。我们的测试结果(表3)也与现有报告一致。

oryzae以其遗传多样性和致病变异而闻名，导致水稻品种的抗性迅速分解。当只转移一个抗性基因时，一个水稻品种通常只在真菌的新优势致病小种出现之前几年保持有效。

对稻瘟病的持久抗性取决于水稻品种同时积累至少两个抗性位点。因此，在北方水稻产区，迫切需要在11号染色体串联重复区挖掘增强抗性的基因。

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